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Revista APF 3(2) 2014
entre 70 y 75 pasos (70 a 75 metros) de la primera.
Luego se dejaron cuatro hileras sin evaluar y se evaluó
la quinta, y así sucesivamente hasta completar las 10
submuestras. En invernaderos medianos y pequeños,
las submuestras se tomaron de manera que quedaran
equidistantes una de otra y dejando aproximadamente
dos pasos (2 metros) de los bordes laterales del inver-
nadero.
La extracción de suelo y de sustrato se realizó con un
barreno helicoidal tipo holandés con hélice de 6.5 cm
de ancho, 20 cm de largo y grosor de 3.5 cm. También,
se utilizó un palín (pala) de 4 pulgadas de ancho y 10
pulgadas de largo. La submuestra se recogió a todo lo
largo de la hélice del barreno o del cuerpo del palín,
tomando con las manos aproximadamente 80 cm
3
,
y se
colectó hasta completar la muestra en una funda plásti-
ca transparente (14 x 20 cm). Las muestras se homoge-
neizaron agitando la funda, se identificaron y se coloca-
ron en nevera hielera portátil para su mantenimiento en
frio y traslado al laboratorio.
Análisis y procesamiento de las muestras
Se utilizó el protocolo descrito por Acuña y Peña (2005).
Se utilizó medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar)
preparado 3 a 5 días antes de la siembra. Para la prepa-
ración se usaron 39 g/l de PDA sintético Oxoid CM0139,
más 5 gramos de agar bacteriological (Oxoid LP 0011).
Esta preparación se colocó en plato agitador caliente
durante 45 a 60 minutos hasta disolver el agar. Poste-
riormente, se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante
15
minutos a 1.2 kg/cm
2
de presión. Antes de distribuirlo
en platos Petri se dejó bajar la temperatura a unos 45
ºC, se le adicionaron 200 mg/l de estreptomicina y 0.62
ml/l (30 gotas) de ácido láctico 80%. Se distribuyeron 10
ml del medio de cultivo en cada plato Petri.
Las muestras de suelo y las muestras de sustrato se
homogeneizaron y se tamizaron en tamiz con abertura
de 4.75 mm. De cada muestra se preparó una dilución
madre en frasco con capacidad para 125 ml. Para esto
se colocaron 10 g de la muestra en el frasco con 90 ml
de agua destilada y esterilizada, el frasco se agitó hasta
preparar una suspensión total del suelo o del sustrato.
Las muestras de raíces se sacudieron hasta desprender
la mayor parte del suelo o sustrato de estas. Se cortaron
en trozos de 0.5 a 1.0 cm de largo, se colocaron (2 a 10
g) en frasco matraz con capacidad de 300 ml y se les
aplicó 150 ml de agua destilada y esterilizada. Luego
se agitaron durante 20 minutos en agitador horizontal
compacto, para preparar la dilución madre.
Las diluciones madres se llevaron a la cabina de flujo
laminar y se prepararon diluciones seriadas 10-2 y 10-3.
De estas diluciones se realizaron siembras en plato pe-
tri con el medio de cultivo PDA. Para esto se colocó 0.1
ml de la dilución y se distribuyó sobre toda la superficie
del medio. Se utilizaron dos platos petri en cada dilución
y se llevaron al incubador a temperatura entre 25 y 30
ºC.
Variables evaluadas
Se evaluó el número de aislados (número de colonias)
de
Trichoderma
por zona y tipo de muestra. La evalua-
ción se realizó ocho días después de la siembra y se
identificaron las colonias en base a sus características
morfológicas. Se registró la cantidad de colonias color
verde o amarillo verdoso, de crecimiento rápido y abun-
dante esporulación, característico de
Trichoderma
.
Purificación y conservación de aislados de
Trichoderma
Para la purificación de los aislados se realizaron cul-
tivos con puntas de hifas en medio PDA. Cuando los
cultivos estuvieron bien esporulados, entre 12 y 15 días,
se recogieron esporas en tiras de papel filtro estéril con
dimensiones de 0.5 cm x 3.0 cm, y se conservaron en
microtubos de 2 ml a temperatura de 5 ºC en la oscu-
ridad.
Análisis de datos
Los datos se analizaron con estadística descriptica me-
diante el uso de tablas de distribuciones de frecuen-
cias.
Zona
Tipo de muestra
Total
Suelo Sustrato Raíz cultivo Raíz maleza
Constanza
7
4
7
0
18
Jarabacoa
7
5
6
0
18
Moca Villa Trina
5
3
5
0
13
Moca Juan López
2
0
2
0
4
San José de Ocoa
7
4
7
0
18
La Vega
7
0
6
6
18
Total
35
16
33
5
89
Tabla 2. Número de muestras tomadas por zona, según tipo de muestra
